•Técnicas Actuales En Biología Molecular•
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)/ PCR punto final
•Permite generar miles de copias de una sola copia de un fragmento de ADN.
•Se usa porque es más fácil analizar y secuencia el fragmento de ADN si se cuenta con muchas copias.
Tiene tres pasos principales:
•Desnaturalización:
-Consiste en separar las dos hebras de DNA rompiendo los puentes de hidrógeno que unen las hebras complementarias.
-Los puentes se rompen por medio de calor a unos 90 o 95 °C, por lo que se dice que son termolábiles.
•Hibridación:
-Se usan unos fragmentos pequeños de DNA llamados oligonucleótidos, o conocidos como cebadores o primers, que tienen de 10 a 18 bases nitrogenadas, y amplifican o son específicas para la reacción que nos interese.
-Por ejemplo, tenemos el genoma completo, pero nos interesa solo un gen, entonces se crean cebadores específicos para este gen, y cuando las dos hebras se separan, el cebador se une al gen que nos interesa.
-Esto pasa a una temperatura menor que la del paso de desnaturalización.
•Extensión:
-La DNA polimerasa empieza a trabajar a partir de los cebadores que se pegaron en el paso anterior.
-A diferencia de la RNA polimerasa, la DNA polimerasa necesita este oligonucleótido o primer para poder iniciar la polimerización.
-Los nucleótidos los toma como trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP. La d es por "desoxi"). Junto con la enzima, estos nucleótidos trifosfatados se integran al fragmento de DNA que se está formando.
•Estos 3 pasos se repiten una y otra vez, cada vez generando más copias.
•Esta técnica sigue un ritmo exponencial.
•Primero tenemos un fragmento de DNA, luego 2, luego 4, después 8, etc.
PCR en tiempo real (RT-PCR)
•Es igual que la técnica de PCR normal, pero en esta se utiliza una molécula que emite fluorescencia a cierta longitud de onda, pero solamente fluórese cuando se una a una molécula de DNA.
•Entre más sean los ciclos de PCR que se produzcan, la fluorescencia será mayor, porque los fluoróforos se unen a las nuevas moléculas de DNA que se están produciendo.
•Con esto podemos cuantificar con cuanto RNA mensajero en un tejido se comienza la reacción.
•Si tenemos mucho RNA mensajero al comienzo de la técnica, en ciclos tempranos se generara una señal con intensidad mayor.
•Esto es útil para saber para comparar por ejemplo un tejido sano y otro canceroso, en el canceroso puede que encontremos más mensajeros de cierto tipo.
Secuenciación de ADN (Sanger)
•Se utiliza para conocer la secuencia del DNA.
•Puede ser usada después de la PCR, debido a que es más fácil secuenciar una secuencia amplificada.
•Esta técnica se basa en el uso de unos nucleótidos trifosfatados especiales.
•El carbono 3' de las ribosas normalmente tieneun alcohol, el cual permite formar el enlace fosfodiéster a la hora de lapolimerización, permitiendo que se unan más nucleótidos.
•Los nucleótidos modificados que se usan en la secuenciación se Sanger se llaman didesoxirribonucleósidos trifosfatos, y carecen del alcohol en el carbono 3'.
• Al no tener ese alcohol se evita que la cadena de DNA siga creciendo y que la polimerasa genere una hebra más larga.
•Entonces si se pega este didesoxirribonucleósido a un fragmento de DNA, la cadena deja de crecer.
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¡¡Érase una vez la vida !!
Diversos& el maravilloso cuerpo comienza aquí. El cuerpo humano es una estructura compleja y altamente organizada, formada por células que trabajan juntas para realizar funciones específicas necesarias para mantener la vida. La biología del cuerpo h...
