Gru è ormai un ex cattivo e si dedica alle sue figlie adottive: Margo, Edith e Agnes. La Lega Anti Cattivi (L.A.C., nel film A.V.L.), un'organizzazione che si occupa di crimini mondiali e dello sventare dei piani dei supercattivi, sta indagando sulla misteriosa scomparsa di un laboratorio Top Secret nel Circolo Polare Artico. Nel laboratorio si sperimentava il siero "PX41", un potente liquido viola capace di trasformare ogni essere vivente in una inarrestabile bestia viola, di cui sono state rinvenute delle tracce al centro commerciale. Per trovare il colpevole, la A.V.L. manda Lucy Wilde (una spia alle prime armi) a catturare Gru perché potrebbe aiutare nelle indagini. Arrivato al quartier generale dell'organizzazione spionistica e dopo aver parlato con il presidente di essa, Gru rifiuta e torna così a casa sua. Sceso nel suo laboratorio sotterraneo, dove ora produce marmellate (chiamata "Marmellosa": una marmellata che contiene il gusto di tutti i frutti immaginabili dal sapore schifoso), Gru incontra il Dr. Nefario che si licenzia perché gli manca fare il cattivo. Quella stessa sera, pensando di non essere più così "mitico", Gru accetta l'offerta della A.V.L. ed il giorno dopo è già in servizio al centro commerciale con Lucy Wilde.
Lì, i due fingono di avere un negozio di muffin ed indagano sugli altri proprietari di negozi; tra i tanti, Gru rimane stupito nel vedere Eduardo (il proprietario di un negozio messicano), che secondo lui è in realtà El Macho, un leggendario criminale morto gettandosi in un vulcano con addosso degli esplosivi. Nottetempo, le due spie entrano furtivamente nel negozio del sospettato ma non trovano alcuna traccia, escludendo così l'ipotesi di Gru. Nel frattempo, all'insaputa di Gru, i minion cominciano a sparire misteriosamente sempre di più; solo tre ne rimangono: Dave, Stuart e Tim. Gli esseri gialli ricompaiono in un isolotto dove si divertono molto, fino a quando non vengono usati come cavie per il siero PX41, rubato dal criminale misterioso. Cercando in un altro negozio, Gru trova delle tracce del siero e, dopo aver avvisato la Lega, viene congedato dalla missione perché essa sembra risolta. Col passare dei giorni, Gru inizia a provare qualcosa per Lucy, ma lei lo informa che dovrà partire per l'Australia per un'altra missione gettando Gru nello sconforto. Anche Lucy capisce di provare qualcosa per Gru e sul volo per l'Australia decide di tornare indietro gettandosi con un paracadute.
Quella stessa sera, Gru va al party a casa di Eduardo perché Margo ed Antonio, figlio del sospetto El Macho, si sono fidanzati anche se durante la serata Antonio lascerà Margo per un'altra ragazza; Gru indaga al party e trova il laboratorio segreto di El Macho, che, intenzionato a ricevere la collaborazione del padrone dei minion, gli spiega il suo piano. Esso consiste nello spedire i minion viola (le versioni viola e senza controllo dei minion) in varie parti del mondo, conquistandolo. Li, prima di rifiutare ed andarsene, Gru incontra anche il Dr. Nefario al servizio di El Macho. Proprio in quel momento, Lucy arriva al party dove viene rapita da El Macho con l'intenzione di prenderla in ostaggio. Il dottore Nefario avvisa il suo ex capo del rapimento di Lucy da parte di El Macho, che aveva scoperto il complotto di Gru e della Lega. Tornato a casa, il Dr. Nefario svela alle ragazze che ha ultimato l'Antidoto PX41 e, dopo averlo mescolato alla grandissima quantità di marmellate presenti in casa, parte per aiutare Gru, Dave e Stuart a salvare Lucy.
Sparando direttamente la marmellata nelle bocche dei minion Viola, fancedoli tornare normali.
El Macho stesso beve il siero "PX41" trasformandosi a sua volta in un enorme mostro viola, ma grazie al rossetto elettrico di Lucy, Gru stordisce El Macho e salva Lucy.
In seguito a tale evento, Gru si fidanza con Lucy e tempo dopo la sposa e così Lucy diventa la nuova mamma di Margo, Edith e di Agnes. Durante i titoli di coda si vedono Kevin, Dave e Jerry che stanno facendo il provino per I minion il film.
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