Desmond Miles, un barman secuestrado por los templarios en el año 2012, consigue huir de la prisión de Abstergo gracias a Lucy Stillman, una asesina actual, Lucy roba la información del Sujeto 16 de Abstergo y se la entrega a Rebecca, la que la introduce en el Animus 2.0 para que Desmond "entrene" en menos tiempo. Tras un par de peleas a golpe limpio con los guardias de Abstergo, escapan en un coche hacia al refugio de asesinos actuales. Allí, como en Abstergo, los asesinos poseen un Animus, una máquina que permite conocer la vida de tus antepasados volviendo a su época. Esta vez, Desmond se transporta al Renacimiento, donde conoce a su antepasado, Ezio Auditore Da Firenze.
Ezio Auditore Da Firenze, un joven italiano que vivía la "dolce vita" a sus 17 años, se encuentra en un momento trágico de su vida, cuando las familias "amigas" de los Auditore conspiran contra su familia y consiguen encarcelarlos. Ezio logra hablar con su padre, Giovanni Auditore, banquero de la ciudad y asesino en secreto, en la cárcel, donde éste le dice a su hijo que vaya a su casa, descubra una habitación contigua y secreta y se apropie de todo lo que encuentre allí. Ezio descubre en la habitación un baúl de su padre, en el cual hay una vestimenta de asesino, una espada y una hoja oculta rota, que más tarde Leonardo Da Vinci reparará. No consigue impedir que asesinen a su padre y a sus dos hermanos, Federico y Petruccio. Ezio huirá de Florencia con lo que le queda de su familia, su hermana y su madre. Es asaltado por un grupo de soldados dirigidos por Vieri de Pazzi, enemigo principal de Ezio, en medio de campo abierto, y rescatado al borde de la derrota por su tío Mario Auditore, que lo lleva a su pequeña villa, Monteriggioni, donde aprende lo básico en lo referente a manejarse con la espada, así como técnicas de evasión y defensa, mientras aprende simultáneamente los secretos de su familia.
Ezio Auditore logrará crecer como hombre a la vez que mejora sus dotes de asesino, fundamentales para llevar a buen puerto los desafíos que le esperan en la Italia Renacentista. Para ello, contará con la ayuda de personajes históricos tan influyentes como Leonardo da Vinci, cuya visionaria concepción del arte, la naturaleza y la tecnología le llevarán a diseñar todo tipo de instrumentos con la única intención de ayudar a su querido amigo Ezio. Más allá de la venganza, se revela la necesidad de perpetrar el trabajo que, durante años, había llevado a cabo su progenitor entre las sombras.
Después de asesinar a todos aquellos que conspiraron contra su padre, se encuentra con el profeta de los caballeros templarios, Rodrigo Borgia, y este logra eludirlo pero pierde el Fruto del Edén. Años después se convierte en Papa logrando así tener el poder de la llave que comparte poderes con el Fruto. Ezio consigue vencer al poderoso templario, aunque, justo antes de asesinarlo, Borgia consigue zafarse y empuja a Ezio. Con ayuda del fruto del Edén en el cetro Papal, consigue abrir una cámara creada por los antiguos en la cual, donde según el templario debería estar Dios. Ezio acaba con él definitivamente antes de que entre en esa extraña cripta. Al penetrar él mismo se encuentra con la diosa Minerva, que habla sobre algo incomprensible para Ezio, pues es un mensaje a Desmond a través de los recuerdos del asesino donde le dice que la tierra perderá su campo magnético y será destruida por el Sol.
Una vez acabado el mensaje de la diosa, se acaba la secuencia del Animus y es justo en ese momento cuando los templarios consiguen averiguar la localización exacta de aquel refugio. Llegan soldados y Warren Vidic, donde tienen una amarga conversación sobre lo que cometió al huir de abstergo, mientras Desmond pelea fieramente con una hoja oculta que Lucy le proporciona antes de marcharse. Durante pleno combate, los cuatro asesinos del refugio consiguen huir, al igual que Warren Vidic y los templarios restantes. La historia acaba con los cuatro asesinos huyendo en una camioneta hacia una cabaña más al norte hablando sobre ponerse a trabajar para averiguar más información para saber como detener los planes de abstergo.
