1539'da 17 yaşındayken Diyarbekir Beylerbeyi Rüstem Paşa ile evlendirildi. Düğün töreni iki küçük erkek kardeşi Bayezid ve Cihangir'in sünnet düğünüyle birlikte At Meydanı'nda şölenlerle kutlandı. Rüstem Paşa bu evlilikten sonra sadrazam oldu ve 1544-1561 yılları arasında 2 yıllık bir süre hariç kesintisiz sadrazamlık yaptı. Bu evlilikten 1541'de bir kız çocukları dünyaya geldi.Daha sonra 1545 te Murat beyi,1547 de Mehmet beyi dünyaya getirdi.
Mihrimah Sultan yaşamı boyunca devlet işlerinde çok söz sahibi oldu. Babasını Malta'ya sefer düzenlemeye ikna etmek için kendi parasıyla 400 gemi yaptıracağına söz verdiği bile söylenir. Annesi Hürrem Sultan gibi Lehistan kralı II. Zygmunt August'la yazışmalar yaptı. Çok büyük bir servet sahibi oldu. 1540-1548 yılları arasında Mimar Sinan İstanbul'un Üsküdar ilçesinde cami Üsküdar İskele Camii, medrese, ilkokul ve hastaneden oluşan büyük bir külliye yaptı. Ayrıca 1562-1565 yılları arasında yine Mimar Sinan İstanbul'un Edirnekapı semtinde cami, çeşme, hamam ve medreseden oluşan Mihrimah Sultan Camii ve külliyesini yaptı.
Annesi 1558'de öldükten sonra babasına annesinin oynadığı danışmanlık rolünü oynadı. 1566'da babası öldükten sonra yerine geçen erkek kardeşi II. Selim'in saltanatı boyunca da danışmanlığını sürdürdü. Anneleri Hürrem Sultan ölmüş olduğu için kardeşi için adeta bir Valide Sultan rolünü oynadı.
