En Egipto, junto a la Gran Pirámide de Guiza, se detiene un autobús lleno de turistas estadounidenses. Mientras toman fotografías, un niño se escapa del cuidado de sus padres y cae accidentalmente sobre la pirámide. Inesperadamente, rebota sobre ella. Así se descubre que la estructura original ha sido robada y sustituida por un doble inflable.
En una escena siguiente, la narración se sitúa en un tranquilo barrio suburbano, rodeado de vallas blancas con floridos rosales, donde hay una casa de color negro con el césped amarillento. Sin que sus vecinos lo sepan, en su subsuelo se halla el escondite secreto del supervillano Gru y su ejército de Minions, pequeños humanoides con forma de pastilla amarilla, vestidos con buzo de trabajo y gafas. Cuando Gru se entera del robo de la pirámide, su orgullo es gravemente herido y para recuperar su posición como el más grande supervillano de la Tierra decide realizar el mayor atraco de la historia mundial: robar la Luna.
Armado con sus planos para la construcción de un cohete, Gru trata de obtener un préstamo del Banco Local del Mal (anteriormente Lehman Brothers), donde conoce a un joven supervillano llamado Vector (como el término matemático). Mientras Gru espera, Vector lo molesta continuamente hablándole de su nombre y de su más reciente invención, una pistola que dispara pirañas. Cuando consigue entrar para hablar con el presidente del Banco, el señor Perkins (doblado por Will Arnett en la versión en inglés) le niega el préstamo hasta que obtenga un rayo reductor, que resulta indispensable para que su plan salga adelante. Perkins continúa, diciendo que Gru se está haciendo ya muy viejo para ser un supervillano, y que ahora hay que concentrarse en supervillanos más jóvenes, que son los que están produciendo más dinero, como Vector, quien resulta ser el ladrón de la pirámide. A la salida del banco, decaído, Gru ve a Vector intentando recargar su pistola lanzapirañas y le dispara con su rayo congelador.
Aunque Gru y sus Minions logran robar el rayo reductor de un laboratorio secreto en Asia Oriental, cuando está escapando aparece Vector y quien a su vez se lo roba, para luego encoger la nave de Gru como venganza por el ataque anterior en el banco. Gru intenta recuperarla infiltrándose en la base de Vector, pero sus intentos resultan inútiles cuando las defensas resultan ser mucho mejores de lo que él preveía. Decaído, ve sin embargo cómo tres niñas huérfanas llamadas Margo, Edith y Agnes consiguen entrar en la guarida para vender galletas. Gru tiene una idea, y decide adoptar a las tres niñas para llevar a cabo su plan. Tras lograr que se las otorguen en adopción, el villano pide a su ayudante, el doctor Nefario, que construya varios robots con forma de galleta de determinadas cualidades, ya que Vector ha realizado un gran pedido de estas.
Al día siguiente, Gru lleva a las chicas hasta la casa de Vector para que entreguen el pedido, y cuando las pequeñas entran, las galletas-robot salen de las cajas, abriendo un hueco en el interior de la cámara acorazada, lo cual permite a Gru y a un par de minions entrar. Los robots, sin embargo, sellan la bóveda de nuevo, imposibilitando su salida. Tras varios momentos en los que están a punto de ser descubiertos por Vector, logran escapar de allí por la puerta principal.
De camino a casa, las niñas piden a Gru que las lleve a un parque de atracciones cercano. Al principio este se niega, pues desea ponerse a trabajar en su plan lo antes posible, pero después accede, con la intención de dejar a las pequeñas allí. Pero el plan fracasa porque el feriante obliga a Gru a montar en la montaña rusa con las niñas, ya que no pueden estar solas, y Gru monta. Una vez hecho esto, estas se paran a jugar en una caseta en la que uno de los premios es un peluche que Agnes quiere. El sitio está, sin embargo, trucado y las pequeñas no consiguen el premio. Gru decide vengarse y utiliza una potente arma que pulveriza la caseta. Gru sin querer le atina a la diana, por lo que el feriante accede a entregar el peluche.
De vuelta a su casa en el suburbio, Gru hace una adaptación del plan y lo presenta al señor Perkins a través de una comunicación por videoconferencia accidentada, pues las chicas y varios minions interrumpen su exposición. Perkins le sorprende de nuevo denegándole el préstamo, diciendo que, si bien no tiene problemas con cómo se desarrollaría el plan, sí los tiene con Gru, una vez más diciendo que le gustaría que fuera Vector el que llevara a cabo el plan. Esto lleva a Gru a un flashback de su infancia, ya que él quería ir a la Luna desde que vio cómo el Apolo 11 llevaba a cabo su misión (en 1969), pero su madre nunca prestaba atención a lo que hacía, incluso cuando hizo una maqueta de un cohete y luego logró construir un cohete que podía despegar. Dicha situación alimentó su deseo de poder ir a la Luna, e hizo que empezara con sus actividades supervillanescas para poder pagar su viaje.
El señor Perkins avisa a Vector que le han robado la pistola de rayos reductores y le dice que ha sido Gru. Entonces se descubre que Vector es en realidad Víctor, el hijo del señor Perkins, y que la razón de que Vector tenga tantas armas es porque Perkins no tiene problema en darle dinero.
Desalentado, Gru baja hasta la base subterránea y les dice a los minions que no pueden seguir adelante con la misión, ya que no tienen fondos para construir el cohete, y que ya no podrán seguir con sus actividades delictivas. Las niñas, intentando animarle, le dan a Gru sus ahorros y los minions se ofrecen a hacer una colecta para poner en marcha el plan. Esto anima a Gru, y decide seguir adelante con el plan, comprando materiales baratos y reciclando otros objetos para poder llevar a cabo la construcción.
Durante el siguiente mes, la construcción del cohete va viento en popa, pero Nefario comienza a ver a las niñas como una distracción para Gru, que está empezando a disfrutar de su papel como padre adoptivo de Margo, Edith y Agnes. Con la construcción casi terminada, Nefario decide llamar a la señorita Hattie, la desagradable dueña del orfanato donde vivían las niñas antes de que Gru las adoptara, para que se las lleve de vuelta al orfanato, diciendo ser Gru. Tanto Gru como las niñas acaban con el corazón roto. Además, el día del robo de la Luna hay también un recital de ballet para el que las chicas han estado entrenando todo este tiempo. Gru sale volando a la Luna, sintiéndose mal por haber dejado ir a las chicas.
Tras encoger el satélite hasta el tamaño de una naranja, Gru lo guarda en uno de sus bolsillos, y permanece flotando en el espacio durante un tiempo hasta que el billete de la obra de ballet (que Agnes le había dado hacía un mes y que uno de los esbirros le había metido en un bolsillo del traje de astronauta antes del despegue) aparece flotando en el espacio. Gru se da cuenta de que todavía tiene tiempo de llegar a la obra y se precipita hacia la Tierra, aterrizando cerca del colegio donde se iba a celebrar el recital. Pero cuando llega la obra ya ha acabado. Triste, Gru va hasta la silla que le había sido reservado y encuentra allí una nota de Vector, que ha raptado a las niñas y exige que le dé la Luna si quiere volver a verlas.
Gru va hasta la fortaleza de Vector y le da la Luna, pero el joven reniega de su acuerdo y decide mantener a las niñas como cautivas. Esto enfurece a Gru, que logra penetrar a través de las defensas de la fortaleza (dejando fuera de combate a un tiburón de un solo golpe de mano) y logra agarrarse a la nave de Vector mientras esta despega, con la Luna y las niñas en su interior. Aunque no consigue agarrarse bien y cae al vacío, es rescatado justo a tiempo por el doctor Nefario y los minions, que están a bordo de la nave que Vector había contraído. Aquel le explica que los efectos del rayo encogedor no son permanentes, y estos empiezan a desaparecer a un ritmo directamente proporcional (el tiempo que tardan en retomar su tamaño es inversamente proporcional al tamaño inicial del objeto) a la masa original del objeto (algo que el doctor llama el "Principio de Nefario").
Mientras Gru sigue persiguiendo a Vector, la Luna empieza a agrandarse debido a que los efectos de la contracción están desapareciendo, y empieza a moverse por el interior de la nave de Vector, distrayéndolo y rompiendo la burbuja de cristal en la que están encerradas las chicas. Éstas consiguen abrir una compuerta, y Agnes y Edith consiguen saltar de la nave de Vector a la de Gru, donde son introducidas por los minions. Cuando Margo intenta saltar, Vector se lo impide, pero un temblor de la nave hace que Vector suelte a Margo, que se agarra a un cable que está uniendo las dos naves. Gru intenta llegar hasta la chica, poniendo en peligro su vida, pero justo cuando Gru está a punto de agarrar a Margo el cable se rompe y los dos caen al vacío. Pero los minions han logrado montar una cadena hecha de minions y agarran a Gru y Margo, salvando sus vidas. Mientras, la Luna, que está en rápida expansión, activa los cohetes de la nave de Vector y la envía al espacio, con Vector justo encima de la nave, lo cual lleva a la Luna hasta su antigua posición en órbita.
Gru y las chicas se establecen como una familia feliz, viviendo con los minions, mientras que Vector está varado en la Luna junto a un minion que había tomado una muestra de suero antigravedad y flotó fuera del laboratorio cuando a Nefario se le olvidó cerrar la claraboya. Las chicas deciden dar un recital especial de ballet para los minions, Gru y la madre de este, quien tras muchos años de descuidar a su hijo le dice que está orgullosa de él por ser tan buen padre. En mitad del recital, uno de los minions cambia El lago de los cisnes a You Should Be Dancing, lo cual hace que todos los minions, Gru y su madre salten a la pista para ponerse a bailar.
