1515 yılında babası Kanuni Sultan Süleyman'ın şehzadeliği sırasında Manisa'da dünyaya geldi. Yavuz Sultan Selim'in 1520'de hayatını kaybetmesi üzerine Osmanlı tahtına oturmak üzere İstanbul'a giden babasının yanında başkente gitti.
Hürrem Sultan'ın babasının sarayına girmesinden sonra annesi Mahidevran Sultan ile Kanuni'ye dört şehzade daha doğuran Hürrem Sultan arasında, Kanuni'den sonra kendi oğullarının tahta çıkmasını sağlamak için büyük bir mücadele yaşandı. Şehzade Mustafa, 1533 -1541 arasında Saruhan Sancakbeyi (Aydın sancağı ilavesiyle) olarak görev yaptı. Saruhan (Manisa), padişah adayının görev yaptığı yer kabul edilirdi, dolayısıyla Şehzade Mustafa dönemin veliaht şehzadesiydi. 16 Mayıs 1541'de Amasya Sancakbeyliğine atandı; Saruhan Sancakbeyliğine ise kardeşi Şehzade Mehmed getirildi. Halk ve askerler bu duruma tepki gösterdi, bunun üzerine I.Süleyman doğu topraklarının güvenliği için şehzadenin Amasya'ya gönderildiğini ve veliahtlığının sürdüğünü açıkladı. Ardından, Mehmet'in beklenmedik şekilde 1543'te ölümünden sonra Saruhan Sancakbeyliğine Şehzade Selim getirilirken; Şehzade Mustafa ise 1549 yılında Konya Sancakbeyliğine atandı.
Şehzade Mustafa'nın şahsına dair önemli verilerden biri de Bernardo Navagero adlı İtalyan elçinin yazdığı bir mektupta hakkında verdiği bilgilerdir.
Diğer bir veri ise Guillaume Postel'in Osmanlı gelenek-göreneklerini ve siyasi durumunu anlattığı kitapta bulunmaktadır. 1536'da, Fransız kralı I. François, Kanuni Sultan Süleyman'la bir sözleşme imzaladı ve ardından resmî tercümanı ve tarihçisi Guillaume Postel'i yardımcı olarak Fransız elçisi olan Jean de La Forêt'in yanına, İstanbul'a gönderdi. Fransız tarihçi Guillaume Postel, "De la République des Turcs" (Türklerin Cumhuriyeti) adlı kitabında Şehzade Mustafa'nın iktidarı devralabilecek yaşa ve olgunluğa ulaştığını, tedbirli ve son derece iyi eğitimli bir şehzade olduğunu yazmaktadır.
