ДНК в криминалистике
Часть 3. Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой обнаружение в биологическом материале малых количеств дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), точнее определённых её фрагментов, и размножение их во много раз с последующей визуальной идентификацией путём электрофореза в геле.
Открытие ПЦР (1983-1984 гг, Кэри Б. Мюллис (Kary B. Mullis), Нобелевский лауреат по химии 1993 г.) произвело революцию в молекулярной биологии, и трудно перечислить всё разнообразие отраслей фундаментальной науки и практической медицины, в которых используется этот метод в настоящее время. Благодаря ПЦР имеется возможность работать с единичными молекулами ДНК, увеличивая их количество в миллионы раз.
ПЦР-анализ — это многоступенчатый процесс. На первом этапе проводится температурная денатурация (денатурация — утрата природной (нативной) конфигурации молекулами нуклеиновых кислот и др. биополимеров в результате нагревания, химич еской обработки и т.п.) ДНК, в результате которой двухнитевые сегменты разделяются на отдельные цепи. Затем происходит гибридизация однонитевых фрагментов с праймерами — короткими (20-25 нуклеотидов) сегментами ДНК. Гибридизация праймеров осуществляется с комплементарными (комплиментарными — взаимодополняющими, облегчающими образование связей о молекулах) им участками ДНК, располагающимися по флангам интересующей двухнитевой последовательности. Далее происходит достройка «дочерней» полинуклеотидной цепи на ДНК-матрице в пределах, ограниченных праймерами, с помощью фермента ДНК-полимеразы. Каждый из этапов реакции требует оптимального для него температурного режима, и, конечно, подбор праймеров для ПЦР осуществляется таким образом, чтобы они связывались именно с теми последовательностями, которые ограничивают анализируемые гипервариабельные локусы (т.е. эти последовательности должны быть заведомо известны).
Амплифицированные (амплифицированное — многократно увеличенное число копий нуклеотидных последовательностей) STR-фрагменты, аналогично VNTR-фрагментам, фракционируют (фракционируют — подвергаются дробной, фракционной перегонке) в геле и визуализируют их, используя различные методы детекции. В последнее время для этих целей принято использовать флуоресцентные метки, возбуждаемые лазерным излучением, поскольку такой метод, хотя он и требует специального оборудования и значительных материальных затрат, является наиболее чувствительным и позволяет проводить исследование в режиме реального времени. Более того, благодаря разноцветным флуоресцентным меткам имеется возможность анализировать несколько локусов (локус — местоположение определённого гена на генетической или цитологической карте хромосомы) одновременно.
