Masha and the Bear bercerita tentang seorang gadis kecil pra sekolah berponi dan selalu menggunakan kerudung bernama Masha, satu-satunya karakter manusia di film ini. Masha adalah bocah yang kepo, hiperaktif (hingga nampak sedikit usil), suka bermain dan doyan dengan permen lolipop. Karakter utama lain adalah Misha, beruang pemburu sahabat Masha. Beruang ini memiliki banyak keterampilan, pandai memasak, suka merawat rumah pohonnya yang berada di tengah hutan. Memiliki peternakan lebah madu dan pekarangannya digarap menjadi lahan pertanian sayur.
Selain dua karakter utama di atas masih ada karakter lain yang juga kadang-kadang muncul. Seperti Dipper-beruang betina tetangga Misha, kumpulan serigala yang tinggal di sekitar mobil ambulans di atas bukit, kelinci pencuri wortel, landak dan tupai yang tinggal di sekitar rumah Misha. Ada juga ayam, babi dan kambing yang biasa muncul di pekarangan rumah Masha dekat rel kereta api. Juga ada karakter khusus yang muncul pada episode-episode tertentu seperti panda, kerabat Misha dan Sinterklas yang gemar membagi hadiah.
Dalam film dilukiskan Misha, si Beruang suka menghabiskan waktunya untuk merawat rumah atau pertaniannya, memasak, bersantai, mengisi TTS dan kegiatan-kegiatan untuk menyenangkan dirinya sendiri. Tapi kesenangannya selalu terganggu dengan kedatangan Masha ke rumahnya.
Tapi Misha tidak marah. Dia dengan sangat terpaksa meladeni Masha yang kepo dan selalu mau bermain dengannya. Disinilah kelucuan film ini. Tingkah pola Masha yang imut dan lucu serta sedikit usil, diimbangi dengan karakter beruang yang besar, suka jengkel dengan ulah Masha. Untuk membayangkan betapa usilnya Masha, bayangkan ayam, babi dan kambing yang tinggal di dekat rumah masha langsung lari bersembunyi begitu Masha keluar dari dalam rumahnya. tapi walaupun Masha rada-rada menjengkelkan, Misha tetap sabar dan meladeninya.
