Biología Celular

ELISA/

El ELISA se basa en el uso de Ag o Ab marcados con una enzima, de manera que el resultado tenga actividad inmunológica y enzimática. 

Al estar marcado el Ag o el Ab la reacción Ag-Ab queda inmovilizada, y por lo tanto será  fácilmente revelada con la adición de un sustrato especifico, que al actuar con la enzima, producirá un color observable o cuantificable por un espectrofotómetro o un colorímetro. 

Pasos generales de un ELISA.

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.

2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.

3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo

4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido

5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima

6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo

7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

8. Adición del substrato

9. Unión del substrato a la enzima

10. Desarrollo del color

Está técnica puede usar los siguientes ensayos:

Ensayo competitivo. Utiliza tubos cubiertos con Antisuero, se mezcla una cantidad conocida de Ag marcado con enzima (empleado como Ag de referencia) con la muestra desconocida. La disminución del producto de reacción es proporcional al Ag presente en la solución de prueba.  Se usa para detectar/ cuantificar Ag en bajas concentraciones o cuando solo hay un Ab disponible. 

En si, tubos con antisuero, se les agg cantidad conocida de Ag marcado con enzima y se añade la muestra desconocida, lo que disminuya, es la cantidad de Ag presente. 

ELISA de doble Ab. Se recubre la pared del tubo con Ab, se agrega el suero de prueba, seguido del Ab conjugado. El producto de la reacción es proporcional a la cantidad de Ag en el líquido de prueba. 

En si, tubos cubiertos con Ab, se añade suero y el Ab conjugado, lo que reaccione es la cantidad de Ab presente.  

Ensayo de inhibición. El líquido de prueba que contiene el Ag se incuba con el antisuero estándar, luego se mide el nivel de Ab restante ELISA en tubos o pocillos cubiertos con Ag. 

En si,  se incuba el líquido que tiene el Ag con antisuero, luego se mide el Ab restante con ELISA.

Los diferentes tipos de ELISA son los siguientes:

Anticuerpos Marcados 

-ELISA Directo.  Se hace el tapizado de Ag específicos,  se hace un lavado para eliminar Ag no fijados, se añaden los Ab marcados con una enzima,  se hace el complejo Ag-Ab, se hace un lavado para eliminar Ab que no reaccionaron, se añade el sustrato que actuara con la enzima marcadora, se realiza la lectura visual o colorimétrica. 

En si, Tapizado Ag, lavado, Añade Ab marcado, lavado,  Añade sustrato, Medición.  

-ELISA indirecto. Se hace el tapizado de Ag específicos, se hace un lavado para eliminar Ag no fijados, se añade el suero problema  para que los Ab reaccionen con los Ag fijados, se hace un lavado para eliminar Ab que no reaccionaron, se añaden los anti-Ab conjugados, que harán reaccionar a los Ab ya unidos, se hace un lavado para eliminar anti-Ab,  se añade el sustrato que actuara con la enzima marcadora, se realiza la lectura visual o colorimétrica.