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Deux mois se sont écoulés depuis l'incident du manoir. Jill Valentine, membre des STARS et rescapée du manoir, est restée à pour enquêter sur un laboratoire secret d'Umbrella. Elle tente d'échapper à la ville infestée par le , 24 heures avant les événements de .
Le 28 septembre, Jill part arpenter les rues infestées de dans l'espoir de trouver une échappatoire. Dans son périple plutôt laborieux, elle tombe nez à nez avec , un membre des , et le sauve d'une attaque de zombies. Hélas, il est tout de même mordu. Ce dernier la prévient qu'il est venu pour éliminer les STARS et qu'il n'y a pas d'échappatoire. Il part aussitôt sans donner plus de détail à Jill, la laissant avec ses interrogations.
Jill se dirige alors vers le poste de police (celui des événements de Resident Evil 2). Devant l'entrée, elle croise Brad, grièvement blessé, qui est rattrapé par une grande créature, le . Ce dernier est un être génétiquement modifié créé par la société biochimique Umbrella dans le but de tuer les agents spéciaux de la police de . Jill se réfugie dans le commissariat et se fraye un chemin jusqu'au bureau des STARS d'où elle entend une transmission radio d'un certain Carlos. Puis elle recroise Nemesis dans les locaux, armé d'un lance-roquettes et répétant sans cesse, comme obsédé, le nom du groupe d'élite de la police.
Sortie du commissariat, elle finit par se retrouver dans un café-restaurant. Là, elle fait la connaissance d'un dénommé qui travaille pour la société pharmaceutique . Jill, au premier abord, ne lui fait pas confiance, puisque Carlos travaille pour l'entreprise responsable de la catastrophe. Mais après l'avoir aidé à survivre lors d'une nouvelle rencontre avec le Nemesis, elle change d'avis. Carlos lui apprend l'existence d'une voie d'évacuation mise en place pour les imprévus, notamment au cas où leur mission échouerait ; un hélicoptère les attend en effet près d'une immense bâtisse à l'apparence gothique flanquée d'une tour d'horloge. Carlos, le sergent Nicholai Ginovaef et le lieutenant Mikhail Victor (blessé) envisagent d'utiliser un tramway pour atteindre la tour plutôt que les routes dangereuses de la ville.
Jill et Carlos se lient d'amitié et s'entraident dans la suite du scénario. Nemesis barre plus que jamais la route des mercenaires tout au long de leur périple, et la ville finit par être la cible d'un sur l'ordre d'un haut responsable américain.
